ELISA夾心法實驗步驟和注意事項

以下是本生ELISA夾心法實驗的標準化操作流程及關鍵注意事項：

一、實驗步驟詳解

抗體包被‌

用pH9.5碳酸鹽緩沖液稀釋捕獲抗體至1-10μg/ml，每孔加入100μl，4℃包被過夜或37℃孵育2小時

棄液后使用含0.1%吐溫的PBS洗板3次，每次浸泡3分鐘并拍干

封閉非特異性位點‌

加入200μl/孔封閉液(3% BSA或5%脫脂牛奶)，37℃孵育1小時

重復洗滌步驟，確保去除未結合封閉劑

樣本孵育‌

加入100μl待測樣本/標準品，37℃孵育1小時，同時設置空白孔與對照孔

標準品需梯度稀釋(建議2倍系列稀釋)，樣本濃度過高時需預稀釋

酶標抗體結合‌

洗滌后加入100μl HRP標記檢測抗體，37℃孵育1小時

嚴格洗板5次以去除游離抗體(關鍵步驟)

顯色與終止‌

每孔加入90-100μl TMB底物，37℃避光顯色15分鐘(觀察標準孔梯度)

加入50μl 2M硫酸終止反應，顏色由藍變黃

結果讀取‌

終止后10分鐘內用酶標儀測定450nm吸光度(參考波長630nm)

　　二、關鍵注意事項

樣本處理‌

血清樣本需6小時內分離，避免溶血(血紅蛋白干擾顯色)

凍存樣本避免反復凍融，檢測前需離心去除沉淀

試劑控制‌

所有試劑使用前平衡至室溫(約30分鐘)，但酶標抗體需避光

不同批號試劑禁止混用，濃縮洗滌液結晶需37℃溶解

操作規范‌

加樣時槍頭勿觸碰孔壁，避免氣泡產生

洗板后需拍干(吸水紙需及時更換)，但避免過度干燥

質量控制‌

陽性對照OD值應≥0.8，陰性對照OD值≤0.2(否則實驗無效)

建議樣本做復孔檢測，CV值應控制在15%以內

三、異常處理建議

高本底值‌：增加封閉液濃度(5% BSA)或延長封閉時間至2小時

顯色異常‌：檢查酶標抗體活性及底物是否失效，顯色時間不超過30分鐘

附：實驗流程時序圖

A[包被抗體] --> B[封閉]

B --> C[加樣本]

C --> D[酶標抗體]

D --> E[顯色]

E --> F[終止測定]

通過規范操作和嚴格質控，可確保檢測靈敏度達到pg級別。

注：以上資料僅供參考，如需具體品牌產品的完整說明，建議提供貨號或廠商名稱以便進一步確認。

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